ГМО вдосконалюватимуться за допомогою штучної еволюції

ГМО вдосконалюватимуться за допомогою штучної еволюції
Гусінь метелика Trichoplusia ni

Генетично модифіковані рослини, захищені від комах-шкідників нешкідливими для інших тварин бактеріальними токсинами, дозволяють різко збільшити врожайність, але ненадовго: комахи швидко пристосовуються до токсинів. Щоб на рівних брати участь в еволюційній гонці озброєнь зі шкідниками, необхідно навчитись розробляти нові токсини, що мають таку ж вузьку дію. Американські біоінженери придумали методику, яка заснована на швидкій еволюції вірусів-бактеріофагів і дозволяє якнайшвидше отримувати нові токсини, небезпечні лише для певної групи комах.

Використання генетично модифікованих рослин у сільському господарстві неухильно ширшає, незважаючи на досі присутню упередженість і необґрунтовані страхи. На сьогодні одним з найпростіших і багатообіцяючих підходів до підвищення врожайності є введення у геном рослин генів ґрунтової бактерії Bacillus thuringiensis, які кодують білкові токсини, небезпечні тільки для певних груп комах і більше ні для кого. Ці токсини, узагальнено названі Bt-токсинами, зв'язуються з рецепторами на поверхні клітин середньої кишки комахи і сприяють утворенню дірок в клітинних мембранах, що призводить до загибелі клітин, а потім і всієї комахи. Кожен Bt-токсин розпізнає тільки «свій» рецептор і тому безпечний для тварин, у яких такого рецептора немає.

ГМ-рослини з вбудованими генами Bt-токсинів використовуються в сільському господарстві вже близько 20 років. Нині ними засіяно 420 млн га. Їх використання істотно підвищило продуктивність сільськогосподарського виробництва.

Однак комахи швидко пристосовуються практично до будь-яких отрут, зокрема і до Bt-токсинів. Стійкі комахи починають з'являтись вже через 5-6 років після впровадження нового трансгенного сорту, а іноді й швидше. Щоб не програти в еволюційній гонці озброєнь, необхідно розвивати «прикладну еволюційну біологію».

Вже розроблено кілька стратегій, які дозволяють уповільнити поширення стійкості в популяціях шкідників. Один з підходів — засівати невеликі ділянки незахищеними рослинами, щоб на цих ділянках добір сприяв комахам, що не мають засобів захисту від отрути. Справа в тому, що вироблення стійкості до отрути як правило (хоч і не завжди) супроводжується негативними побічними ефектами, тому в конкуренції за неотруєні рослини стійкі комахи програють нестійким. Але це вимагає від фермерів певного рівня грамотності і навіть альтруїзму: не кожен погодиться перетворити частину свого наділу на розплідник для шкідників. Інший підхід — змусити рослину виробляти одразу кілька різних токсинів, спрямованих проти одних і тих же шкідників. Нарешті, можна просто частіше міняти токсини. Але де взяти стільки різних токсинів, кожен з яких до того ж повинен мати вузьку дію і не шкодити нікому, крім певної групи комах?

Американські біоінженери з Гарвардського і Корнелльського університетів та компанії Монсанто опублікували в журналі Nature статтю, в якій описують новий хитромудрий метод, що дозволяє за допомогою штучної еволюції швидко отримувати нові модифікації Bt-токсинів з необхідними властивостями.

На поверхні клітин кишечника комах є багато потенційних мішеней для Bt-токсинів (різних білкових рецепторів), але далеко не всі вони використовуються існуючими в природі Bt-токсинами. Отже, можна спробувати змінити ту частину амінокислотної послідовності токсину, яка служить для розпізнавання рецептора-мішені, так, щоб токсин почав зв'язуватись з якимось іншим рецептором. У всьому іншому токсин можна лишити без змін. В результаті отримаємо новий токсин, який так само ефективно руйнуватиме мембрани клітин кишечника, але прикріплятися він буде до інших поверхневих білків цих клітин. Відомо, що стійкість комах до Bt-токсинів зазвичай розвивається за рахунок мутацій, що змінюють відповідний поверхневий білок або зовсім відключають його експресію (без багатьох білкових рецепторів прожити можна, а ось з продірявленими клітинами кишкового епітелію — ні). Таким чином, змінивши специфічність токсину (змусивши його розпізнавати інший рецептор), можна подолати набуту комахами стійкість.

Але як змінити специфічність токсину? Для цього потрібна не одна і не дві, а багато амінокислотних замін. На жаль, сучасні знання про зв'язок амінокислотної послідовності білка з його функціональністю досі недостатні, щоб просто взяти і спроектувати потрібний білок на папері або комп'ютері. Тому найкращим методом залишається «дарвінівська еволюція в пробірці», тобто випадкові мутації і добір. Адже природа теж не змогла винайти нічого кращого. Зокрема, цей принцип використовує імунна система хребетних для вироблення специфічних антитіл, що вибірково зв'язуються з певним антигеном.

Щоб отримати нові токсини, автори модифікували недавно винайдену технологію «безперервної еволюції за допомогою фагів» (phage-assisted continuous evolution, PACE). Суть метода PACE полягає в тому, що в бактерію вставляють маленьку додаткову хромосому (плазміду), яка містить ген вірусного білка, необхідного для розмноження вірусу-бактеріофага. При цьому регуляторну область даного гена конструюють так, щоб ген вмикався тільки за наявності в клітині білка, що має певні властивості (evolving protein). Потім бактерій заражають бактеріофагами, що не мають вищезгаданого гена. Натомість у геном фагів вставлена генетична заготовка: ген того самого «еволюціонуючого білка», який дослідники хочуть змінити шляхом штучної еволюції (evolving gene). Все відбувається в проточному резервуарі з постійним надходженням нових бактерій, які вимиваються звідти швидше, ніж встигають розмножитись. Фаги, однак, розмножуються швидше за бактерій, тому в системі PACE еволюціонують лише вірусні гени, а не бактеріальні чи плазмідні. Селективну перевагу отримують ті фаги, чий «еволюціонуючий ген» забезпечує найбільш ефективне виробництво закодованого у плазміді білка. На додачу в бактеріальні клітини додається ще одна плазміда. Вона містить генетичну конструкцію, що дозволяє регулювати темп мутації, змінюючи концентрацію цукру арабінози в середовищі.

Головна перевага цієї технології полягає в тому, що вона дозволяє проводити штучну еволюцію в автоматичному режимі впродовж багатьох поколінь поспіль. Досі розробка нових білків методом штучної еволюції, як правило, вимагала людського втручання на кожному кроці. Процес виходив дуже трудомістким, і тому справа найчастіше обмежувалась лише кількома поколіннями реплікаторів, тоді як для серйозних еволюційних змін потрібно, як правило, багато поколінь. Раніше вдалось частково автоматизувати штучну еволюцію рибозимів, але на еволюцію білків цю технологію перенести важко. Те, що біологи тепер можуть змусити віруси — реплікатори з найшвидшою у природі еволюцією — автономно «винаходити» потрібні людині білки, це, безумовно, вражаюче досягнення.

Втім, система PACE досі не використовувалась для отримання білків, що вибірково зв'язуються з іншими білками.

Автори поставили собі за мету отримати нову модифікацію широко використовуваного в генній інженерії Bt-токсину Cry1Ac, яка зв'язувалася б з рецептором TnCAD метелика Trichoplusia ni — небезпечного шкідника. Природний токсин Cry1Ac, присутній у бактерії Bacillus thuringiensis, не зв'язується з цим рецептором, а метелики вже встигли виробити до нього стійкість.

Система PACE була модифікована так. У геном бактеріофага як «еволюціонуючий ген» вставили ділянку токсину Cry1Ac, що служить для розпізнавання рецептора хазяйської клітини. У плазміду перед геном білка, необхідного для розмноження вірусу, вставили регуляторну область, яка містить ділянку ДНК, що розпізнається спеціальним ДНК-зв'язуючим білком. У плазміді також є ген, що кодує цей ДНК-зв'язуючий білок, сполучений з «мішенню» — фрагментом рецептора TnCAD метелика-шкідника. Таким чином, щоб запустити експресію необхідного для розмноження вірусу білка, токсин, закодований в геномі фага, повинен приєднатись до «мішені». В результаті розмножитись зможуть тільки ті віруси, чий Cry1Ac хоч трохи прилипає до TnCAD. Чим сильніше він прилипатиме, тим швидше розмножуватимуться віруси.

Однак рецептор TnCAD настільки несхожий на природні мішені токсину Cry1Ac, що останній до нього взагалі не прилипає, тому добору спочатку нема за що зачепитись. Спроби одразу використовувати TnCAD як мішень не увінчалися успіхом: жоден вірус не зміг розмножитись. Тоді автори виготовили «проміжну сходинку» для штучної еволюції: модифікований варіант TnCAD, в якому три амінокислоти були замінені так, щоб ключова ділянка білка, яка розпізнається Bt-токсинами, стала більше схожою на природні мішені Cry1Ac.

Це допомогло, і за 276 годин еволюції (що відповідає такому ж числу поколінь фагів, оскільки зміна поколінь у них відбувається приблизно кожну годину) вдалось вивести кілька варіантів Cry1Ac, які надійно прилипають до модифікованого TnCAD. Після цього мішень замінили на звичайний TnCAD, і ще через 252 години були отримані варіанти Cry1Ac, які ефективно зв'язуються з цим рецептором.

Від початкового Cry1Ac нові токсини відрізняються 10-12 амінокислотними замінами. Це багато: отримати такі білки без PACE, вручну розмножуючи гени і відбираючи білки на кожному кроці, було б украй важко.

Втім, це ще була не остаточна перемога. Отримані білки зв'язуються з TnCAD, але чи зберегли вони свою смертоносність для метелика-шкідника? Як з'ясувалось, ні. Експерименти показали, що нові білки втратили стійкість до травних ферментів гусениці: вони руйнуються у її кишечнику і майже не мають токсичної дії.

Такий результат був цілком очікуваним. Адже в ході штучної еволюції добір йшов лише на здатність Cry1Ac зв'язуватися з рецептором TnCAD, а всі інші властивості білка ігнорувались. Щоб все-таки отримати ефективний токсин, авторам довелось «скасовувати» закріплені мутації по одній і дивитись, як це вплине на токсичність. В результаті з'ясувалось, що на ранніх етапах штучної еволюції, коли як мішень використовувався ще не справжній TnCAD, а його модифікований варіант, в еволюціонуючому Cry1Ac закріпились дві амінокислотні заміни, які і зробили білок вразливим до травних ферментів гусениці. Забравши ці заміни (тобто повернувши відповідні амінокислоти в початковий стан), дослідники отримали ефективний токсин, що вбиває будь-яких гусениць T. ni: як стійких до звичайного Cry1Ac, так і нестійких. Смертоносність нового токсину для стійких метеликів виявилась зіставною з токсичністю початкового Cry1Ac для метеликів, які ще не набули стійкості до Cry1Ac. Таким чином, набуту шкідником стійкість вдалось успішно подолати. Новий токсин вбиває тільки гусениць T. ni і ряду близьких видів метеликів, які мають схожий рецептор, але нешкідливий для всіх інших тварин.

Дослідження показало, що у вічній битві людини з комахами за урожай нам все-таки є що протиставити швидко еволюціонуючим шкідникам. Поставивши собі на службу віруси, які еволюціонують ще швидше, людство зможе як мінімум на рівних брати участь в еволюційній гонці озброєнь з комахами-фітофагами. Ймовірно, тепер виробництво ГМ-рослин з новими інсектицидними білками можна буде поставити на потік, що дозволить значно збільшити продуктивність сільського господарства в глобальному масштабі. З огляду на те, що населення Землі вже в середині нинішнього століття наблизиться до позначки 10 мільярдів, значення нової технології важко переоцінити.

X

Вхід

Завантажую...