Працьовиті мутанти

Працьовиті мутанти

Ці живі істоти вже ніколи не зможуть жити на волі. Їх геном багаторазово перекроєний заради єдиного завдання — невтомно працювати на людину. Мільйони цих біороботів виробляють у величезних кількостях те, що самим їм практично не потрібно. Вони чинять спротив, вони хотіли б жити інакше, але хто ж їм це дозволить?

За вступним пасажем, написаним у стилі антиутопії, насправді стоїть буденна реальність. Мова йде про мікроорганізми, спеціально адаптовані для роботи в біотехнологічному виробництві. Взагалі мікроорганізми — бактерії і гриби — «горбатяться» на людство з незапам'ятних часів, причому до відкриттів Луї Пастера люди навіть не здогадувались, що, замішуючи дріжджове тісто, сквашуючи молоко, виготовляючи вино чи пиво, вони мали справу з роботою живих істот.

Але як би там не було, інтуїтивно, методом стихійної селекції протягом тисячоліття людям вдалось відібрати з природних, «диких» форм мікроорганізмів високоякісні культури для виноробства, сироваріння, хлібопечення. Інша справа, що вже в новітню епоху працьовитим бактеріям були знайдені нові застосування. Виникли великотоннажні біотехнологічні підприємства з виробництва, наприклад, таких важливих хімічних продуктів, як амінокислоти або органічні кислоти.

Суть біотехнологічного виробництва в тому, що мікроорганізми, поглинаючи вихідну сировину, наприклад цукор, виділяють метаболіт, продукт обміну речовин. Цей метаболіт і є кінцевим продуктом. Проблема лише в тому, що в клітині присутні кілька тисяч метаболітів, а виробництву потрібен один, зате в дуже великих кількостях — наприклад, 100 г/л (при тому, що в природних умовах метаболіт вироблявся б в кількостях, на два-три порядки менших). Ну і зрозуміло, бактерії повинні працювати дуже швидко — видавати потрібний обсяг продукту, скажімо, за дві доби. Такі показники диким формам вже не під силу — для цієї «потогінної» системи потрібні супермутанти, організми з десятками різних модифікацій геному.

Ближче до природи

Тут варто задатись питанням: а навіщо взагалі залучати біотехнології — хіба хімічна промисловість не справляється з виробництвом тих же амінокислот? Справляється. Хімія в наші дні може багато, проте біотехнології мають кілька серйозних переваг. По-перше, вони оперують поновлюваними ресурсами. Зараз в якості сировини в основному використовуються крохмало- і цукровмісні рослини (пшениця, кукурудза, цукровий буряк). В майбутньому, як вважається, активно використовуватиметься целюлоза (деревина, солома, макуха). Натомість хімічна галузь працює переважно з викопними вуглеводнями.

По-друге, в основі біотехнологій лежать ферменти живих клітин, які працюють при атмосферному тиску, нормальній температурі, у водних неагресивних середовищах. Хімічний синтез протікає, як правило, при величезному тиску, високих температурах, з використанням їдких, а також вибухо- і пожежонебезпечних речовин.

По-третє, сучасна хімія побудована на застосуванні каталітичних процесів, а в ролі каталізаторів, як правило, виступають метали. Метали не відносяться до поновлюваної сировини, а застосування їх ризиковане з точки зору екології. В біотехнології функцію каталізаторів виконують самі клітини, які за необхідності можна легко утилізувати: вони розкладаються на воду, вуглекислий газ і невелику кількість сірки.

І нарешті, четверта перевага полягає у властивостях одержуваного продукту. Наприклад, амінокислоти — це стереоізомери, тобто ці молекули мають дві форми, які мають однакову структуру, але просторово організовані як дзеркальні відображення одне одного. Оскільки L- і D-форми амінокислот по-різному заломлюють світло, такі форми називають оптичними.

З точки зору біології, між формами є істотна відмінність: тільки L-форми біологічно активні, тільки L-форма використовується клітиною як будівельний матеріал для білка. При хімічному синтезі виходить суміш ізомерів, витягання з неї правильних форм — окремий виробничий процес. Натомість мікроорганізм, як біологічна структура, продукує речовини лише однієї оптичної форми (у випадку амінокислот — тільки в L-формі), що робить продукт ідеальною сировиною для фармацевтики.

Битва з клітиною

Отже, завдання підвищення продуктивності для біотехнологічних виробництв природними штамами вирішити не можна. Необхідно використовувати методи генної інженерії, щоб фактично змінити стиль життя клітини. Всі її сили, вся її енергія, і все, що вона споживає, має бути спрямоване на мінімальний ріст і (в основному) на виробництво у великих кількостях потрібного метаболіту, будь то амінокислота, органічні кислоти чи антибіотик.

Яким чином створюються бактерії-мутанти? У недавні часи це виглядало так: брали дикий штам, потім проводили мутагенез (тобто обробку спеціальними речовинами, які підвищують кількість мутацій). Оброблені клітини розсівали, отримуючи тисячі окремих клонів. І були десятки людей, які перевіряли ці клони і шукали мутації, найбільш ефективні для продуцентів.

Найбільш перспективні клони відбирали, і наставала черга наступної хвилі мутагенезу, і знову розсіювання, і знову відбір. По суті, все це мало чим відрізнялось від звичайної селекції, давно використовуваної в тваринництві та рослинництві, якщо не зважати на застосування мутагенезу. Так десятиліттями вчені відбирали кращих з численних поколінь мікроорганізмів-мутантів.

Сьогодні використовується інший підхід. Тепер все починається з аналізу шляхів метаболізму і виявлення основного шляху конверсії цукрів до цільового продукту (а шлях цей може складатись з півтора десятка проміжних реакцій). Адже в клітині, як правило, присутні багато побічних шляхів, коли вихідна сировина йде на якісь зовсім непотрібні виробництву метаболіти. І для початку всі ці шляхи потрібно відсікти, щоб конверсія спрямовувалась безпосередньо на цільовий продукт. Як це зробити? Змінити геном мікроорганізму.
Для цього використовуються спеціальні ферменти і невеликі фрагменти ДНК — «праймери». За допомогою так званої поліциклічної реакції в пробірці можна витягнути з клітини окремий ген, скопіювати його у великій кількості і змінити.

Наступне завдання — повернути ген у клітину. Вже змінений ген вставляють у «вектори» — це невеликі кільцеві молекули ДНК. Вони здатні переносити змінений ген з пробірки знову в клітину, де він заміщає старий, нативний ген. Таким чином можна ввести або мутацію, яка повністю порушує функцію непотрібного виробництву гена, або мутацію, яка змінює його функцію.

В клітині існує дуже складна система, яка перешкоджає надмірному виробництву будь-якого метаболіту, того ж лізину наприклад. Природним шляхом він виробляється в кількості приблизно 100 мг/л. Якщо його виявиться більше, то сам лізин починає інгібувати (сповільнювати) реакції, які призводять до його виробництва. Виникає негативний зворотний зв'язок, виключити який можна лише за допомогою введення в клітину чергової генної мутації.

Однак розчистити шлях сировини до кінцевого продукту і зняти вбудовані в геном заборони на зайве виробництво необхідного метаболіту — це ще не все. Оскільки формування потрібного продукту проходить всередині клітини певну кількість стадій, на кожній з них може виникнути «ефект пляшкового горлечка». Наприклад, на одній зі стадій фермент працює швидко і проміжного продукту виробляється багато, а на наступній стадії пропускна здатність падає і незатребуваний надлишок продукту загрожує життєдіяльності клітини. Значить, необхідно посилити роботу гена, який відповідає за повільну стадію.

Посилити роботу гена можна, підвищивши його копійність — іншими словами, вставивши в геном не одну, а дві, три чи десять копій гена. Інший підхід — «підшити» до гену сильний «промотор», або ділянку ДНК, яка відповідає за експресію конкретного гена. Але «розшивка» одного «пляшкового горлечка» зовсім не означає, що воно не виникне на наступній стадії. Тим більше що чинників, які впливають на перебіг кожної стадії отримання продукту, дуже багато — необхідно враховувати їх вплив і вносити корективи в генну інформацію.

Таким чином «змагання» з клітиною може тривати довгі роки. На вдосконалення біотехнології виробництва лізину пішло приблизно 40 років, і за цей час штам «навчили» виробляти за 50 годин 200 г лізину на літр (для порівняння: чотири десятиліття тому цей показник становив 18 г/л). Але клітина продовжує чинити спротив, адже такий режим життєдіяльності для мікроорганізму вкрай важкий. Працювати на виробництві вона явно не хоче.

І тому, якщо регулярно не стежити за якістю клітинних культур, в них неминуче виникнуть мутації, які знижують продуктивність, і які охоче будуть підхоплені відбором. Все це говорить про те, що біотехнологія — це не така річ, яку можна розробити одноразово, а потім вона буде діяти сама. І необхідність підвищувати економічну ефективність і конкурентоспроможність біотехнологічних виробництв, і запобігання деградації створених високопродуктивних штамів — все вимагає постійної роботи, в тому числі фундаментальних досліджень в області функцій генів і клітинних процесів.

Залишається одне питання: чи безпечні організми-мутанти для людини? Що як вони потраплять з біореакторів у навколишнє середовище? На щастя, ніякої небезпеки немає. Ці клітини неповноцінні, вони абсолютно не пристосовані до життя в природних умовах і неминуче загинуть. Мутантна клітина змінена так, що вона може рости лише в штучних умовах, в певному середовищі, при певному типі харчування. Зворотного шляху в дикий стан для цих живих істот вже немає.

X

Вхід

Завантажую...